雌激素的缺乏和糖皮質激素的使用是導致骨質疏松癥的常見原因。去卵巢致骨質疏松癥大鼠模型相對成熟，而對于糖皮質激素注射后大鼠骨量的變化并沒有形成共識。本研究應用先進的 QDＲ4500A型扇形束雙能 X 線測定骨密度儀\\( DXA\\) 測量糖皮質激素注射后大鼠的全身、離體腰椎、離體股骨和脛骨及其興趣區的骨密度\\( BMD\\) 、骨礦含量\\( BMC\\) 、骨骼面積\\( Area\\) ，以去卵巢大鼠組作為陽性對照，以假手術 + 未注射糖皮質激素大鼠組作為陰性對照，探討其在模型中的價值和骨丟失的情況。

1 實驗對象和方法

1. 1 大鼠分組和模型的建立

42 周齡雌性 SD 大鼠 21 只\\( 購自中南大學動物學部 SCXK 2006-0002\\) ，平均體重 367 g。飼養在22 ℃ ～ 25 ℃ ，每日 12 h 光照，12 h 黑暗的環境中，任意進食中南大學動物學部自產大鼠全價顆粒飼料\\( 含 1. 53%鈣、0. 9% 磷\\) 和自來水。適應性飼養 2周后，隨機分成 3 組: 假手術 + 未注射糖皮質激素組\\( SHAM\\) 、去卵巢組\\( OVX\\) 、注射甲基強的松龍組\\( PＲED\\) 。OVX 組: 3% 戊巴比妥鈉按 0. 1ml/100g體重腹腔注射麻醉大鼠滿意后，取背部正中切口，切開皮膚皮下并向兩側游離皮下組織，在左側肋下旁開中線 1 橫指處剪開肌肉和腹膜，在腹腔脂肪中找到并切除左側卵巢組織，右側操作同左側，逐層縫合并撒青霉素粉劑; SHAM 組手術操作步驟相同但僅切除與卵巢組織大小相似的腹腔脂肪組織; PＲED組每日皮下注射甲基強的松龍 2. 5 mg/kg\\( PfizerManufacturing Belgium，NV\\) 。

1. 2 DXA 掃描

1. 2. 1 全身 DXA 掃描: 分別于術前\\( 0 周\\) 、術后 4周、術后 8 周、處死前\\( 12 周\\) 應用 QDＲ4500A 型扇形束 DXA\\( Hologic，US\\) 掃描大鼠并用附帶小動物軟件進行分析。掃描前用人體腰椎體模和小動物階梯模型校正。將大鼠麻醉后，取俯臥位行全身掃描，該儀器測定大鼠全身 BMD 的批內 CV 為0. 71%。
1. 2. 2 離體骨 DXA 掃描: 術后 12 周，行全身 DXA掃描后，處死所有大鼠。取出子宮后，用電子天平\\( 湖南湘儀廠\\) 稱重。取出雙側股骨、雙側脛骨、腰椎\\( L4-L6\\) ，仔細剝離附著的肌肉和結締組織并分離腰椎，對其行高清晰度掃描。按股骨和脛骨測量圖像的長度，將其等分成 7 個區\\( Ｒ1 ～ Ｒ7\\) ，各區被稱為感興趣區\\( ＲOI\\) ，分別測量各區的 BMD、BMC、Area，此分析方法是將各骨骼富含松質骨或皮質骨的成分相對劃區，并基于松質骨和皮質骨兩者在骨代謝上的差異，從而發現骨丟失的敏感區域。脛骨由近端向遠端依次劃分，股骨由遠端向近端依次劃分\\( 圖 1\\) 。
1. 3 壓縮試驗

壓縮試驗是骨生物力學試驗中較為重要的一種。完成離體骨 DXA 掃描后，用慢速鋸\\( Buehler 公司，美國\\) 除去第二腰附件和椎間盤，將圓柱形的腰椎椎體置于力學試驗機\\( CSS44100，長春機械科學研究院有限公司\\) 的壓縮工作臺中心位置上，驅動機器以 2 mm/min 的實驗速度對試樣施加壓應力，直至腰椎椎體破壞。連續記錄載荷應變曲線\\( Load-deformation Curves\\) 并計算出最大載荷 \\( maximumloading，ML\\) 和彈性模量\\( elastic modulus，EM\\) 。

1. 4 統計學處理

用 SPSS16. 0 統計軟件進行統計分析，各指標以均數 ± 標準差\\( x珋 ± s\\) 表示，組間均數先進行 χ2正態分布和方差齊性檢驗，若符合正態分布和方差齊性，則采用單因素方差分析\\( one-way ANOVA\\) ，多重比較再采用 LSD-t 檢驗。若不符合正態分布和方差不齊性，則采用多重秩和檢驗，多重比較用 Mann-Whiteney 法，P ＜ 0. 05 表示差異有顯著性。

2 結果

2. 1 術后 12 周子宮重量

術后 12 周 SHAM 組子宮重量\\( 654 ± 51\\) mg，OVX 組子宮重量 \\( 132 ± 9 \\) mg，約是 SHAM 組的0. 20 倍，PＲED 組子宮重量為 \\( 613 ± 60 \\) mg。與SHAM 組比較，OVX 組子宮重量非常顯著降低\\( P ＜0. 01\\) ，PＲED 組與 SHAM 組之間無差異顯著性。

2. 2 大鼠全身 DXA 掃描結果

表 1 顯示了 3 組大鼠在術前\\( 0 周\\) 、術后 4 周、術后 8 周、處死前\\( 12 周\\) 不同時期的體重、BMD、BMC、Area 的變化情況。SHAM 組大鼠體重增長緩慢，在術后 4 周、8 周、12 周時較 0 周分別增長了1. 80% 、4. 63% 、7. 46% 。大鼠在去除卵巢后體重迅速增加，在 4 周、8 周、12 周時較 0 周分別增長了13. 90% 、22. 19% 、28. 07% ，從第 8 周開始體重顯著重于同時期的 SHAM 組大鼠\\( 8 周時 P ＜0. 05，12 周時 P ＜0. 01\\) 。大鼠在皮下注射甲基強的松龍后體重迅速減輕，在 4 周、8 周、12 周時較 0 周分別減輕了 7. 31%、9. 14%、8. 09%，從第 4 周開始體重顯著輕于同時期的 SHAM 組大鼠\\( P ＜ 0. 05\\) ，非常顯著輕于同時期 OVX 組大鼠\\( P ＜0. 01\\) 。雖然 OVX 組大鼠骨骼面積有逐漸增加的趨勢，但是同時期各組大鼠 BMD、Area 之間無差異顯著性，OVX 組大鼠BMC 在第 12 周時顯著高于同時期 SHAM 組大鼠\\( P＜ 0. 05\\) ，在第 8、12 周時顯著高于 PＲED 組大鼠\\( P＜ 0. 05\\) 。
2. 3 離體骨 DXA 掃描結果

2. 3. 1 離體腰椎 DXA 掃描結果\\( 表 2\\) : 與 SHAM組比較，OVX 組第 5、6 腰椎 BMD 顯著降低\\( P ＜0. 05\\) ，降低幅度分別為 10. 28% 、11. 49% ，第 6 腰椎 BMC 亦顯著降低\\( P ＜0. 05\\) 。PＲED 組與 SHAM組比較，BMD、BMC、AＲEA 均無明顯差異。OVX 組第 5、6 腰椎 BMD、第 6 腰椎 BMC、Area 亦顯著低于PＲED 組。

2. 3. 2 離體股骨和脛骨 DXA 掃描結果 \\( 表 3、表4\\) : 與 SHAM 組比較，大鼠去卵巢 12 周后整體股骨及其遠端\\( FＲOI-1、2\\) 和近端\\( FＲOI-6、7\\) 各兩個區域、脛骨近端一個區域\\( TＲOI-1\\) BMD 顯著丟失，其中以松質骨組成占優勢的 TＲOI-1\\( -11. 40%\\) 和FＲOI-2\\( -10. 85% \\) 骨丟失率最大，股骨中段\\( FＲOI-3 ～ 5\\) 和整體脛骨及其中段\\( TＲOI-2 ～ 4\\) 部分區域BMD 無顯著性變化，以皮質骨組成占優勢的脛骨中遠段 TＲOI-5\\( 7. 85%\\) 和 TＲOI-6\\( 8. 65%\\) BMD 顯著增加。去卵巢后整體股骨及其遠端\\( FＲOI-2\\) 、脛骨近端一個區域\\( TＲOI-1\\) BMC 顯著減少，而骨面積無顯著變化。
與 SHAM 組比較，甲基強的松龍注射大鼠12 周后整體股骨和股骨各個感興趣區的 BMD、BMC、AＲEA 無顯著性差異，整體脛骨和脛骨各個感興趣區 BMD 無顯著性差異，脛骨中遠段\\( TＲOI-5、6\\)BMC、AＲEA 顯著性增加。
2. 4 骨生物力學指標變化

第二腰椎壓縮試驗參數見表 5。OVX 組最大載荷與彈性模量顯著低于 SHAM 組\\( P ＜0. 01\\) ，PＲED組最大載荷顯著低于 SHAM 組\\( P ＜0. 05\\) ，OVX 組與 PＲED 組間無統計學差異。3 討論

目前，骨質疏松癥日益增多，雌激素的缺乏和糖皮質激素的使用分別是原發性骨質疏松癥和繼發性骨質疏松癥的最常見病因。部分患者由于某些疾病比如哮喘、紅斑狼瘡、腎病綜合癥等需要長期使用糖皮質激素，成人口服強的松 6 個月將導致腰椎骨量下降 5% ～ 15% 并使骨折風險增加。大鼠是研究骨質疏松癥的常用模型動物之一，但是現有研究對于大鼠接受糖皮質激素后骨量的變化并沒有一致結論。有研究表明，甲基強的松龍能增加 5 周齡大鼠脛骨干骺端 BMD，降低 8 周齡大鼠脛骨干和32 周齡大鼠腰椎的 BMD。Hulley PA 等給 3. 5月齡大鼠皮下注射甲基強的松龍 3. 5 mg/\\( kg·d\\) ，9周后發現股骨 BMD 顯著下降。Ferretti JL 等應用肢端定量 CT\\( pQCT\\) 分別分析皮質骨和松質骨BMD，發現大劑量糖皮質激素能降低 30 日齡股骨骨皮質 BMD，而 McHugh NA 等卻在 7 日齡大鼠脛骨骨皮質中得出了不一致的結論。
上述研究表明糖皮質激素導致的 BMD 改變與大鼠的年齡和測定部位顯著相關。因此，在我們的實驗中，筆者選用 44 周齡\\( 大于 10 月齡\\) 成年雌性大鼠，減少了增齡的影響，而且全面測定各個部位BMD，排除部位特異性，并且以獲得廣泛共識的模擬絕經后骨質疏松癥的去卵巢雌性大鼠模型作為陽性對照。
我們的研究發現 SHAM 組大鼠體重增加緩慢，在 56 周齡時僅較 44 周齡時增加了 7. 46%，BMD、BMC 等指標相對恒定，表明大鼠成年后增齡對其骨量無顯著影響。大鼠接受甲基強的松龍后，與SHAM 組比較其全身骨骼、腰椎、股骨及股骨各區、脛骨及脛骨各區\\( 除 TＲOI-5、6 外\\) 的 BMD、BMC、Area 指標沒有顯著改變。PＲED 組大鼠體重顯著下降，這是由于其導致了肌肉組織萎縮和脂肪重新分布，但是 BMD、BMC 亦沒有對體重減輕產生適應性改變，可能是體重下降的程度還不足以啟動骨重建機制，在術后 12 周時較術前僅下降了8. 09% 。我們在觀察大鼠活體整體骨量和離體骨整體骨量變化的同時，對股骨和脛骨的 DXA 圖像進行連續性分割，將其等分為 7 個區并分別測量各區的BMD、BMC、Area，而不是采用目前常用的單個選取興趣區的方法進行觀察。此分析方法是將各骨骼富含松質骨或皮質骨的成分相對劃區，可以為pQCT、顯微 CT 等試驗篩選骨丟失敏感區域。在PＲED 組中，無論是在以松質骨結構為主的股骨和脛骨的干骺端以及腰椎，還是在以皮質骨為主的全身骨骼及股骨干和脛骨干，都沒有發現明顯的骨丟失區域。在陽性對照 OVX 組，在以松質骨結構為主的第 5、6 腰椎，股骨遠端和近端的干骺端以及脛骨近端干骺端 BMD、BMC 顯著下降，這與以往研究相一致，而且我們進一步發現以皮質骨結構占優的全身骨骼 BMC 逐漸增加，在 12 周時與 SHAM 組比較出現顯著性差異，但整體骨骼面積亦有增加的趨勢，從而導致 BMD 無明顯變化，這提示當組間體重增減不平衡時，BMC 或者 BMD 單獨評價骨量的改變是不全面的。
本實驗中，與 SHAM 組比較，OVX 組和 PＲED組大鼠離體脛骨干及其中遠端部分區域骨量顯著增加，其具體機制還需要進一步研究。大鼠接受甲基強的松龍注射后，生物力學試驗中最大載荷顯著下降，彈性模量也有下降趨勢，但是骨量并不能解釋生物力學性能的改變，這提示糖皮質激素更多的是引起骨質量的改變而導致了力學性能的下降及骨折的發生，具體機制需要進一步研究。
綜上所述，成熟期大鼠接受甲基強的松龍后，皮質骨和松質骨骨量沒有顯著變化，DXA 檢查難以發現甲基強的松龍注射成熟期雌性大鼠的骨丟失情況，其力學性能下降，提示糖皮質激素更多的是引起骨質量的改變而導致了力學性能的下降及骨折的發生。

【 參 考 文 獻 】
［1］ Wu XP，Liao EY，LU ZY，et al． Evaluation of rat bone massmeasurement by dual-energy X-ray absorptiometry anddetermination of sensitive regions of bone loss in ovariectomizedrat． Chin J Endocrinol Metab，2000，16\\( 4\\) : 212-215．
［2］ De Nijs ＲN． Glucocorticoid-induced osteoporosis: a review onpathophysiology and treatment options． Minerva Med，2008，99\\( 1\\) : 23-43．
［3］ T van Brussel MS，Bultink IE，Lems WF． Prevention ofglucocorticoid-induced osteoporosis． Expert Opin Pharmacother，2009，10\\( 6\\) : 997-1005．
［4］ Wang Y， Ohtsuka-Isoya M， Shao P， et al． Effects ofmethylprednisolone on bone formation and resorption in rats． Jpn JPharmacol，2002，90\\( 3\\) : 236-246．
［5］ Lindgren JU，Merchant CＲ，De Luca HF． Effect of 1，25-dihydroxyvitamin D3 on osteopenia induced by prednisolone inadult rats． Calcify Tissue Int． ，1982，34\\( 3\\) : 253-257．
［6］ Wimalawansa SJ， Simmons DJ． Prevention of corticosteroidinduced bone loss with alendronate． Proc Soc Exp Biol Med，1998，217\\( 2\\) : 162-167．
［7］ Hulley P A，Conradie M M，Langeveldt C Ｒ，et al． Glucocorticoid-induced osteoporosis in the rat is prevented by the tyrosinephosphatase inhibitor， sodium orthovanadate． Bone，2002，31\\( 1\\) : 220-229．
［8］ Ferretti JL，Gaffuri O，Capozza Ｒ，et al． Dexamethasone effectson mechanical， geometric and densitometric properties of ratfemur diaphyses as described by peripheral quantitativecomputerized tomography and bending tests． Bone，1995，16\\( 1\\) :119-124．
［9］ McHugh NA，Vercesi HM，Egan ＲW，et al． In vivo rat assay:bone remodeling and steroid effects on juvenile bone by pQCTquantification in 7 days． Am J Physiol Endocrinol Metab，2003，284: E70-E5．
［10］ Schakman O，Gilson H，Kalista S，et al． Mechanisms of muscleatrophy induced by glucocorticoids． Horm Ｒes，2009，72 \\( Suppl1\\) : 36-41．
［11］ Peckett AJ， Wright DC， Ｒiddell MC． The effects ofglucocorticoidson adipose tissue lipid metabolism． Metabolism，2011，60 \\( 11\\) : 1500-1510．
［12］ Martin Ｒ B． The importance of mechanical loading in bonebiology and medicine． J Musculoskelet Neuronal Interact，2007，7\\( 1\\) : 48-53．
［13］ Ke HZ，Simmons HA，Pirie CM，et al． Droloxifene，a newestrogen antagonist / agonist，prevents bone loss in ovariectomizedrats． Endocrinology，1995，136\\( 4\\) : 2435-2441．
［14］ Omi N，Ezawa I． The effect of ovariectomy on bone metabolismin rats． Bone，1995，17: 163-168．