研究發現 Wnt/β-catenin 信號傳導通路涉及骨骼發育的各個方面，激活 Wnt/β-catenin 信號通路能促進成骨細胞始祖細胞增殖和分化，增加成骨細胞的活性，從而促進新骨形成，增加骨密度。骨質疏松發生的分子生物學機制可能涉及 Wnt/β-catenin 信號通路的改變。本研究觀察去卵巢對 SD 大鼠Wnt / β-catenin 信號通路中的低密度脂蛋白受體相關蛋白 5\\( LＲP5\\) 、β-catenin mNＲA 表達的影響。
1 材料與方法
1. 1 材料與設備 雙能 X 線骨密度測量儀\\( Dexa，美國\\) ; 奧林巴斯光學顯微鏡\\( 日本\\) ; Laica 切片機\\( 德國\\) ; FTC2000 實時熒光定量基因擴增儀\\( Funglyn，加拿大\\) ; 雌二醇\\( E2\\) 、骨源性堿性磷酸酶\\( BALP\\) 、抗酒石酸酸性磷酸酶\\( TＲACP5b\\) 酶聯免疫法試劑盒\\( 羅氏公司，美國\\) ; LＲP5 單克隆抗體\\( Genetex ，美國\\) ，β-catenin 單克隆抗體\\( 武漢博士德生物工程有限公司，中國\\) ; Trizol 試劑\\( Invitrogen，美國\\) ; ＲevertAidTMFirst Strand cD-NA Synthesis kit \\( Fermentas，德國\\) ，Taq DNA PCＲ 反應試劑盒\\( Takara，中國\\) ，其余試劑均為市售分析純。3 月齡未育雌性SD 大鼠 20 只，由四川大學華西醫院實驗動物中心提供。
1. 2 方法
1. 2. 1 分組與造模 實驗動物飼養于四川大學華西醫院動物實驗中心，清潔級環境。適應性飼養 1 w 后，按隨機數字表法把 20 只實驗大鼠隨機分為正常對照組和去勢組，每組 10 只。參照 Gregory 等〔5〕對去勢組大鼠施行雙側卵巢切除術，術后每只大鼠肌肉注射青霉素 4 萬 U，1 次/d，連用 3 d 以預防感染。正常對照組大鼠不作任何處理。每只實驗大鼠分籠飼養在溫度 20℃ ～26℃，濕度 60% ～70%，12 h 間隔照明自由攝食。
1. 2. 2 標本采集及處理 去勢手術后 12 w，眼眶取血 2 ml，室溫靜置2 h，低溫3 000 r/min 離心15 min，每份分3 次用移液管取上層血清約 300 ～500 μl，分別置于 3 個 1. 5 ml EP 管中，于－70℃ 冰箱中保存備用。
1. 2. 3 血清 E2、BALP 和 TＲACP5b 檢測 采用 ELISA，嚴格按照試劑說明書操作，測定血清 E2、BALP 和 TＲACP5b 水平。
1. 2. 4 骨密度測定 雙能 X 線骨密度測量儀測定實驗動物左股骨骨密度。處死大鼠后，迅速取出左側股骨、剝離肌肉、生理鹽水沖洗，將股骨放在盛有深約 2. 5 cm 的蒸餾水\\( 用于模擬股骨周圍的軟組織\\) 的容器中，用小動物軟件進行掃描。
1. 2. 5 LＲP5 及 β-catenin mＲNA 的 ＲT-PCＲ 檢測 參照 Trizol說明書，提取大鼠右股骨中骨髓的總 ＲNA，參照試劑盒說明書進行 ＲT-PCＲ，采用 β-actin 作為內參。LＲP5 引物上游: 5'-GA-CATTTACTGGCCCAATGG-3'，引物下游 5'-CTGCCCTCCACCAC-CTTCT-3'，引物間片段長 131 bp; β-catenin: 引 物 上 游: 5'-GGAAAGCAAGCTCATCATTCT-3'， 引 物 下 游 5'-AGTGCCTGCATCCCACCA-3'，引物間片段長 171 bp; β-actin: 引物上游 5'-GCCAACACAGTGCTGTCT-3'，引 物 下 游 5'-AGGAGCAAT-GATCTTGATCTT-3'，引物間片段長 114 bp。PCＲ 反應條件: ①94℃ 2 min ②94℃ 20 s，55℃ 30 s，60℃ 40s，共 45 個循環。根據動力學曲線確定每個樣品管中熒光強度增加到某一特定閾值時的擴增循環數\\( Ct 值\\) ，將原始數據\\( Ct 值\\) 換算為基因的相對表達量\\( 2－ΔΔCt\\) 用于統計分析。
1. 2. 6 Western 印跡檢測 取大鼠右股骨中骨髓 100 mg 提取蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并將蛋白轉至硝酸纖維素膜上; 分別加入 LＲP5 及 β-catenin 單克隆抗體，4℃孵育過夜; 二抗常溫下孵育 2 g 行 DAB 顯色和定量分析，利用圖像分析軟件測定電泳條帶的光密度值，目的蛋白相對定量值=目的蛋白條帶光密度值/β-actin 蛋白條帶光密度值。
1. 3 統計學方法 采用 SPSS13. 0 軟件行組 t 檢驗。
2 結 果
2. 1 血清 E2、BALP 和 TＲACP5b 水平 手術后12 w 去勢組血清 E2水平為\\( 23. 94 ±6. 69\\) pg/ml，比正常對照組 \\( 42. 70 ±12. 48\\) pg / ml 顯著降低\\( P＜0. 01\\) ; 去勢組的血清 BALP 水平為\\( 108. 50±7. 23\\) U/L，比正常對照組\\( 91. 30±7. 31\\) U/L 顯著增加\\( P＜0. 01\\) ; 去勢組的血清 TＲACP5b 水平為\\( 12. 92 ±2. 94\\) U/L，比正常對照組\\( 8. 54±2. 33\\) U/L 顯著增加\\( P＜0. 01\\) 。
2. 2 骨密度檢測 手術后 12 w 去勢 組 的 左 股 骨 密 度\\( 0. 242±0. 020\\) g/cm2，比正常對照組\\( 0. 281 ±0. 021\\) g/cm2下降 13. 9%\\( P＜0. 01\\) 。
2. 3 ＲT-PCＲ 檢測 去勢組 β-catenin mＲNA 表達 \\( 2. 49 ±0. 84\\) 比正常對照組\\( 1. 14 ±0. 65\\) 顯著增高\\( P＜0. 05\\) ，盡管去勢組 LＲP5 mＲNA 表達\\( 1. 62 ±0. 94\\) 比正常對照組\\( 1. 05 ±0. 33\\) 高，但兩組差異沒有統計學意義\\( P＞0. 05\\) 。
2. 4 Western 印跡檢測 去勢組 β-catenin 蛋白表達\\( 0. 31 ±0. 13\\) 比正常對照組\\( 0. 21 ±0. 05\\) 顯著增高\\( P＜0. 05\\) ，盡管去勢組 LＲP5 蛋白表達\\( 0. 31±0. 13\\) 比正常對照組\\( 0. 20±0. 03\\)高，但兩組差異沒有統計學意義\\( P＞0. 05\\) 。見圖 1。
3 討 論
Wnt / β-catenin 信號通路是一種進化非常保守的信號通路，從低等生物到高等哺乳動物都廣泛存在，在生物發育、細胞轉運及細胞凋亡等生命過程中發揮重要作用并且與腫瘤的發生密切相關，Wnt/β-catenin 信號通路還可以通過干細胞更新、促進成骨細胞始祖細胞增殖和分化、誘導成骨細胞發生、抑制成骨細胞和骨細胞凋亡等機制，促進新骨形成，增加骨密度。
經典 Wnts 信號通路的細胞分子包括 Wnts、LＲP5、β-catenin 和 T細胞因子/淋巴增強子結合因子\\( TCF/LEF\\) 等。LＲP5 是成骨細胞膜上 Wnts 的輔助受體; 能誘導細胞內一系列的信號傳遞，在骨骼系統發育和維持骨量的過程中起到重要作用。在人類功能缺失的 LＲP5 基因突變導致以骨密度降低為特點的骨質疏松癥-假神經膠質瘤綜合征的發生，而功能獲得性 LＲP5 基因突變引起骨密度增加。
β-catenin 是一種鈣黏蛋白，它直接與鈣黏素和肌動蛋白細胞支架連接，對細胞黏附和遷移很重要，調節細胞增殖和生存，是 Wnt/β-catenin 信號通路的重要組成部分，是經典 Wnts 信號通路激活的必要條件，在有 Wnts 信號存在時，Wnts 信號通過蛋白 Disheveled、軸蛋白\\( Axin\\) 和 Frat-1 傳遞至抑制 β-catenin 的蛋白質復合物 \\( APC\\) ，Axin 和糖原合成酶激酶 3\\( GSK3\\) 并抑制 GSK3 的活性，釋放 β-catenin，從而 β-catenin 在胞質內聚集并進行核轉位，在核內，它與 TCF/LEF 轉錄因子相互作用，介導 Wnts 對基因轉錄的多種效應。本研究結果提示去勢大鼠 Wnt/β-catenin 信號通路被激活，基于 β-catenin在骨形成的重要作用，推斷去卵巢促進了大鼠新骨的形成，這從去勢大鼠的血清 BALP 顯著增高得到證實，因為 BALP 反映成骨細胞活性，可以作為骨形成的生化指標。但是去勢大鼠的骨密度總趨勢是下降的，這是因為去勢后，雌激素降低導致骨吸收增加，在本研究結果說明大鼠去勢后骨吸收增加，骨吸收大于骨形成最終導致骨密度下降。本研究結果說明去卵巢 12 w 后大鼠 Wnt /β-catenin 信號通路被激活，在去勢大鼠骨組織代謝和骨重建過程中起到重要作用。然而一項研究發現大鼠去卵巢 4 w 和 8 w 后 Wnt /β-catenin 信號通路被抑制。究其原因，Wnt/β-catenin 信號通路在去勢大鼠中的功能狀態可能與去卵巢的時間有關。
本研究提示 β-catenin 介導的經典 Wnts 信號通路被激活。Wnt / β-catenin 信號通路作為促進骨形成機制的核心，該通路所涉及的靶位或因子有望成為開發新的抗骨質疏松藥物的潛在作用位點。研究發現〔12〕電針足三里、三陰交能促進去勢大鼠 LＲP5、β-catenin 的表達，激活 Wnt /β-catenin 信號通路，從而增加骨密度。然而，由于該信號通路參與了很多基本的生命過程，如胚胎的發生、組織器官的生成等，而且此通路的激活與腫瘤的發生密切相關，因而通過激活 Wnt/β-catenin信號通路的機制來治療骨質疏松的靶向藥物及各種治療方法的安全性和副作用，需深入研究和全面評估。
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