臨床中多種慢性氣道炎性反應疾病\\( 如 COPD、哮喘等\\) 往往伴有支氣管收縮及重塑產生的氣道狹窄，由此引發氣道內壓力增高，氣道壁上皮細胞受壓增加。而黏液高分泌作為這類疾病的突出病理表現，是疾病發生、發展及預后的重要影響因素。
黏蛋白5AC\\( MUC5AC\\) 是氣道上皮尤其是病理狀態下的主要黏蛋白表型，在氣道黏液高分泌疾病中最具代表性。黏著斑激酶\\( focal adhesion kinase，FAK\\) 能介導機械牽拉所導致的 EＲK1 /2 活化。而 EＲK1/2 是已知的多種刺激因素誘導 MUC5AC表達和杯狀細胞化生的關鍵性酪氨酸激酶。那么，FAK 是否在機械壓力誘導的氣道黏液分泌的信號傳導通路中起作用呢? 該研究中以 FAK 為切入點，研究機械壓力作用于氣道上皮細胞所產生的對氣道黏液分泌的調控作用及信號傳導機制，以期探明機械壓力在氣道黏液高分泌調控機制中作用及其分子機制，為控制疾病狀態下氣道收縮狹窄狀態提供新的思路。

1 材料與方法

1. 1 主要試劑及材料

正常人氣道上皮 NHBE 細胞和 BEBM 培養基\\( 均 Clonetics 公司\\) ; DMEM 培養基\\( Mediatech 公司\\) ; Transwell 培養板\\( Corning 公司\\) ; ＲPMI 培養基、胎牛血清、TＲIzol 試劑和抗 β-肌動蛋白的單克隆抗體\\( Sigma 公司\\) ; 脂質體 Oligofectamine\\( Invitro-gen 公司\\) ; 鼠抗 MUC5AC 45M1 單克隆抗體 \\( Neo-marker 公司\\) ; 鼠抗 FAK 單克隆、鼠抗 FAK 磷酸化位點多克隆\\( 抗 FAK Tyr397\\) 抗體、鼠抗磷酸化細胞外信號調節激酶 1/2\\( p-EＲK1/2\\) 單克隆抗體、表皮生長因子受體\\( EGFＲ\\) 阻斷劑 AG1478、p-EＲK1/2抑制劑 PD98059\\( Cell Signaling 公司\\) ; PrimeScriptＲT 試劑盒 \\( 大連寶生物公司\\) ; FastStart UniversalSYBＲ Green Master\\( Ｒox\\) \\( 德國羅氏公司\\) ; 引物由\\( 上海生工公司合成\\) ; FAK siＲNA 和對照 siＲNA\\( Dharmacon 公 司\\) ，FAK siＲNA 序 列 為: FAK1，NNGCAUGUGGCCUGCUAUGGA; FAK2，UUUGGCGGUUGCAAUUAAATT。

1. 2 方法

1. 2. 1 細胞培養: NHBE 細胞接種于組織培養瓶中，加入支氣管上皮細胞培養液，置于 37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱孵育，常規換液培養，當細胞匯合達 70% ～ 80% 時傳代，將培養好的 2 代或 3代細胞接種到 Transwell 培養板中的多微孔聚碳酸酯膜上。Transwell 培養板插入配套 6 孔板中，形成上、下室，加入 1: 1 混合的支氣管上皮細胞培養液/達爾伯克必需基本培養基混合培養液繼續培養，上、下室培養液相同。每 2 天更換培養液至細胞長滿纖維膜并融合，去掉上室培養液，建立氣液相界面供試驗使用，繼續每 2 天更換下室培養液。
1. 2. 2 壓力實驗裝置及分組: 參照文獻［7 － 8］。Tr-answell 培養板上室加上帶進氣口的硅膠塞形成密閉小室，進氣口連接氣泵，通過向上室內輸送濕化的37 ℃ 、5% CO2的空氣，控制上室氣壓，而下室仍處于大氣壓，從而使得多微孔聚碳酸酯膜上的NHBE細胞受到跨細胞壓力。參照文獻［1，8］，氣液相界面培養14 d開始，采用 30 cm H2O 壓力作用于 NHBE 細胞，每天1 h，連續7 d，模擬慢性氣道炎性性疾病中氣道收縮時氣道上皮細胞受到的慢性機械壓力。
1. 2. 3 細胞分組: 將形成氣液相界面的 NHBE 細胞分組處理: 1\\) 空白對照組: 無血清培養基繼續培養，不予任何刺激; 2\\) 機械壓力組: 細胞每天予以 30 cmH2O 壓力作用 1 h，連續 7 d; 3\\) 轉染 FAK siＲNA 對照組; 4\\) 機械壓力 + 轉染 FAK siＲNA 組。
在探討 EＲK1/2 在機械壓力誘導的 MUC5ACmＲNA 及蛋白表達中的作用實驗中，采用 EＲK1 /2特異性抑制劑 PD98059 作為干預因素，將細胞分為以下 4 組: 空白對照組、機械壓力組、PD98059 對照組和 PD98059 + 機械壓力組。
在探討 FAK siＲNA 聯合 EGFＲ 特異性抑制劑AG1478 對機械壓力誘導的 MUC5AC mＲNA 和蛋白表達的影響的實驗中，將細胞分為以下 6 組: 空白對照組、機械壓力組、AG1478 對照組、AG1478 + 機械壓力組、FAK siＲNA + AG1478 對照組和 FAK siＲNA+ AG1478 + 機械壓力組。
1. 2. 4 FAK siＲNA、對照 siＲNA 轉染: 在轉染前 1天將處于指數增長期的 NHBE 細胞按\\( 1 ～ 2\\) ×106個/mL的濃度在無血清條件下接種到培養板中，待細胞融合至 40% ～ 50%時進行轉染。操作步驟按照脂質體 Oligofectamine 說明書進行。參照文獻【9】，將 FAK siＲNA 與 Plus Ｒeagent 在 Opti-MEM 培養液中結合。用 Opti-MEM 培養液稀釋的脂質體以10 μg / mL 的濃度進行轉染。轉染 6 ～ 8 h 后，將0. 5 倍容積的含 20% 血清的 ＲPMI 培養液加入到細胞中繼續轉染 48 h。轉染后 24 ～ 48 h 于熒光顯微鏡下觀察熒光，以此鑒定轉染是否成功及轉染效率。
1. 2. 5 實時熒光定量 PCＲ 檢測 MUC5AC mＲNA 的表達: 細胞總 ＲNA 提取及濃度、純度鑒定按參考文獻［10］方法進行。cDNA 反轉錄按照 PrimeScript 反轉錄試劑盒說明書進行。人 MUC5AC\\( AF015521\\)引物序列為: 上游5'-CTGGACATGACCTGTTACAGC-3'，下 游 5'-AGCTGGCCTTCTTGTGCACGC-3'。 人GAPDH \\( NM _ 002046 \\) 引物序列為: 上游 5'-TGTTCGTCATGGGTGTGAACC-3'，下游 5'-CATGAGTCCTTCCACGATACC-3'。按照試劑盒說明建立 10 μLPCＲ 反應體系，反應參數為 95 ℃ 變性 10 min，95 ℃變性 15 s，55 ℃退火 30 s，40 個循環。采用 2－ ΔΔCt的方法分析目的基因 mＲNA 的相對表達量。Ct 是達到熒光閾值所需的循環數，ΔΔCt = 實驗組\\( Ct 目的基因 － Ct 管家基因\\) － 對照組\\( Ct 目的基因 － Ct管家基因\\) 。
1. 2. 6 ELISA 法檢測細胞分泌的 MUC5AC 蛋白含量: 按參考文獻［11］方法進行。
1. 2. 7 Western blot 檢測 FAK、p-EＲK1 /2 蛋白表達: 步驟按參考文獻［11］方法進行\\( 鼠抗 FAK 單克 隆、鼠 抗 FAK 磷 酸 化 位 點 多 克 隆 \\( 抗 FAKTyr397\\) 抗體、鼠抗 p-EＲK1 /2 單克隆抗體終濃度均為 1∶ 1 000\\) 。

1. 3 統計學分析

采用 SPSS17. 0 統計軟件包，所有數據均以均值± 標準差\\( x ± s\\) 表示，兩樣本均數間比較采用 t 檢驗，多樣本均數間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2. 1 FAK siＲNA 轉染對 NHBE 細胞合成 FAK 蛋白的干擾效率

FAK1 和 FAK2 siＲNA 轉染組細胞表達 FAK 蛋白相對含量分別為\\( 0. 28 ±0. 03\\) 和\\( 0. 32 ±0. 04\\) ，均顯著低于對照 siＲNA 組的\\( 0. 68 ± 0. 06\\) \\( P ＜0. 01\\) 和未轉染對照組的\\( 0. 74 ± 0. 07\\) \\( P ＜ 0. 01\\)\\( 圖 1\\) 。由于 FAK1 siＲNA 和 FAK2 siＲNA 均有顯著干擾效率，故在后續實驗中采用兩者結合的一個siＲNA 來進行 ＲNA 干擾。
2. 2 機械壓力對 FAK 磷酸化的影響

機械壓力組細胞表達 FAK 磷酸化位點 Tyr397蛋白相對含量\\( 0. 39 ±0. 03\\) 較空白對照組的\\( 0. 25 ±0. 02\\) 有顯著提高\\( P ＜ 0. 05\\) \\( 圖 2\\) 。
2. 3 FAK 在機械壓力誘導的 MUC5AC mＲNA 及蛋白表達的影響

與空白對照組相比，機械壓力能顯著升高MUC5AC mＲNA 及蛋白含量\\( P ＜ 0. 01\\) ; FAK siＲNA轉染則可顯著降低由機械壓力所誘導的上述指標的升高\\( P ＜0. 05\\) ; 但是，機械壓力 + 轉染 FAK siＲNA組細胞表達 MUC5AC mＲNA 及蛋白水平較轉染 FAKsiＲNA 組仍然是增加的\\( P ＜ 0. 05\\) \\( 表 1\\) 。
2. 4 FAK 在機械壓力誘導的 EＲK1 /2 磷酸化中的作用

與空白對照組的\\( 0. 43 ±0. 07\\) 相比，機械壓力組細胞 p-EＲK1/2 蛋白表達相對含量\\( 0. 79 ±0. 05\\)顯著增加\\( P ＜0. 01\\) ; 與機械壓力組相比，機械壓力+ 轉染 FAK siＲNA 組細胞表達 p-EＲK1 /2 蛋白相對含量\\( 0. 60 ±0. 04\\) 顯著減少\\( P ＜0. 05\\) ; 但是，與轉染 FAK siＲNA 對照組的\\( 0. 41 ±0. 02\\) 相比，機械壓力 + 轉染 FAK siＲNA 組細胞表達 p-EＲK1/2 蛋白相對水平仍然是增加的\\( P ＜0. 05\\) \\( 圖 3\\) 。

2. 5 EＲK1 /2 在機械壓力誘導的 MUC5AC mＲ-NA 及蛋白表達中的作用

PD98059 + 機械壓力組細胞 MUC5AC mＲNA 及蛋白相對表達水平與機械壓力組相比顯著降低\\( P ＜0. 01\\) \\( 表 2\\) 。
2. 6 FAKsiＲNA 聯合 EGFＲ特異性抑制劑AG1478 對機械壓力誘導的 MUC5AC mＲNA 和蛋白表達的影響FAK siＲNA 聯合 AG1478 能夠顯著抑制單純機械壓力誘導的 MUC5AC mＲNA 和蛋白表達\\( P ＜0. 01\\) ; AG1478 單獨作用可顯著降低由機械壓力所誘導的上述指標的升高\\( P ＜ 0. 05\\) ，但與 AG1478對照組相比差異仍具有顯著性\\( P ＜0. 05\\) \\( 表 3\\) 。
3 討論

FAK 在機械牽拉所導致的 EＲK1 /2 活化中起重要介導作用。而 EＲK1 /2 是已知的多種刺激因素誘導 MUC5AC 表達和杯狀細胞化生的關鍵性酪氨酸激酶。因此，FAK 可能在機械壓力誘導的氣道上皮細胞 MUC5AC 表達中起信號傳導作用。
該研究發現，機械壓力能夠誘導人支氣管上皮細胞 FAK 最重要的自身磷酸化位點-酪氨酸位點Tyr397 的磷酸化水平增高。小干擾 ＲNA\\( small in-terfering ＲNA，siＲNA\\) ，可以序列特異性與靶 mＲNA序列結合，導致特異性 mＲNA 的降解，從而穩定持續地維持較長時間的基因沉默。該研究中所采用的 FAK siＲNA 質粒在實驗中被證實可特異性地成功下調 NHBE 細胞 FAK 蛋白的表達。研究同時發現，機械壓力能夠誘導 NHBE 細胞 MUC5ACmＲNA和蛋白及磷酸化 EＲK1 /2 蛋白的表達顯著增加，FAK siＲNA 則能夠有效降低但卻不能完全抑制機械壓力誘導的上述效應，而 EＲK1/2 特異性抑制劑 PD98059 卻能顯著并完全抑制機械壓力誘導的MUC5AC mＲNA 和蛋白的表達，提示機械壓力誘導的 MUC5AC 高表達的信號傳導通路為 EＲK 依賴的，FAK 為 EＲK 的上游信號分子，但可能存在其他非 FAK 依賴的 EＲK 激活信號通路。
支氣管收縮產生的氣道壓力增加可經表皮生長因子受體\\( epidermal growth factor receptor，EG-FＲ\\) 信號通路完成細胞外機械信號向細胞內化學信號傳導，并參與調節絲分裂原激活的蛋白激酶\\( mitogen-activated protein kinase，MAPK\\) 信 號 通路。因此，EGFＲ 可能是誘導 EＲK 活化并最終導致 MUC5AC 表達增加的另一上游機械傳導通路。
在后續的實驗中發現，EGFＲ 特異性抑制劑 AG1478與 FAK siＲNA 一樣單獨作用于 NHBE 細胞時能夠顯著降低但卻不能完全抑制機械壓力誘導的MUC5AC mＲNA 及蛋白的表達，而將兩者聯合作用于 NHBE 細胞則能完 全 抑 制 機 械 壓 力 誘 導 的MUC5AC 的高表達，同時，EＲK 傳導通路上游部分的 EGFＲ 的活化在各種因素誘導的氣道黏液高分泌信號傳導通路中居中心地位，因此，EGFＲ 為另一重要的機械壓力誘導的 EＲK 激活及 MUC5AC 表達的上游信號通路。
研究結果初步證實了 FAK、EGFＲ 所介導的機械壓力促人支氣管上皮細胞 MUC5AC 表達效應，并進一步闡明了 EＲK 信號傳導通路在其中所起的作用，從而加深了對氣道黏液高分泌的機械傳導機制的了解，為慢性氣道炎癥性疾病防控提供一個新的研究思路。

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