腦內神經炎癥與慢性神經退行性疾病如阿爾茨海默病\\( Alzheimer’s disease，AD\\) 、帕金森病\\( Parkinson’sdisease，PD\\) 和多發性硬化\\( multiple sclerosis，MS\\) 等的發生和發展密切相關。而炎癥反應介導的神經元退行性病變主要是膠質細胞的激活及神經毒性因子的釋放。在致炎因素作用下，星形膠質細胞被激活成反應性星形膠質細胞，可釋放多種細胞因子和趨化因子，包括腫瘤壞 死 因 子 α \\( tumor necrosisfactor-α，TNF-α \\) 、白細胞介素 1β \\( interleukin-1β，IL-1β\\) 、IL-6 以及單核細胞趨化蛋白 1 \\( monocytechemoattractive protein 1，MCP-1\\) 和巨噬細胞炎性蛋白 1α\\( macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α\\) ，促使神經元凋亡和壞死。炎性細胞因子和趨化因子還可以誘導外周淋巴細胞和單核細胞通過血腦屏障\\( blood brain barrier，BBB\\) 進入腦內，誘發二次炎性反應，加重神經元損傷。但研究也發現，星形膠質細胞除上述致炎作用外，還具有抗炎的功能，包括形成膠質瘢痕防止神經元繼發變性以及釋放神經營養因子等。因此，研究星形膠質細胞在神經系統炎癥中的雙重作用機制，對理解 MS、AD 和 PD 等的發病機制和對其治療具有重要意義。硫辛酸\\( lipoic acid，LA\\) 化學名稱為 1，2-二硫戊環-3-戊酸，分子式為C8H14O2S2，廣泛分布于動植物以及微生物的肝臟、腎臟等組織中。LA 以兩種不同的異構體存在，即Ｒ-LA\\( 右旋\\) 和S-LA\\( 左旋\\) ，藥用 LA 通常為左旋和右旋的混旋體。
LA 是目前已知唯一的同時在脂溶性和水溶性環境中都能發揮抗氧化性能的物質，被醫學界譽為“萬能抗氧化劑”。研究發現，LA 可以下調脂多糖\\( lipopolysaccharide，LPS\\) 誘導的單核細胞的激活及急性炎性反應。LA 通過增加 cAMP 和激活蛋白激酶A\\( protein kinase A，PKA\\) 減輕 MS 的炎性反應，LA 可通過增加星形膠質細胞谷氨酸的攝取、谷氨酸合成酶的活性和谷胱甘肽的含量起保護作用，CC亞族趨化因子20\\( CC chemokine ligand-20，CCL20\\) 對表達 CCL20 受體 CCＲ6 的細胞具有趨化作用，如Th17 細胞、調節性 T 細胞等，而上述細胞在 MS 的動物模型實驗性自身免疫性腦脊 髓炎\\( experimentalautoimmune encephalomyelitis，EAE\\) 中發揮重要作用。
EAE 發病期間，星形膠質細胞是 CCL20 的主要來源，本研究主要觀察 LA 對 LPS 激活的星形膠質細胞分泌 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-10 及相關趨化因子的影響。

1 材料和方法

1． 1 材料 C57BL /6J 小鼠\\( 體質量 16 ～ 18 g\\) ，由中國醫學科學院實驗動物中心提供。LA、LPS\\( 來自 E． coli 0111: B4\\)購自 Sigma 公司; TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-10 ELISA 測定試劑盒購自 PeproTech 公司; M-MLV 逆轉錄酶購自 Promega 公司; GADPH 引物、CCL20、MCP-1 和 MIP-α 引物由生工生物合成; TＲIzol 試劑、DMEM、胎牛血清、高糖培養基購自Gibco-BＲL公司。

1． 2 方法

1． 2． 1 小鼠原代星形膠質細胞的培養 新生 C57 / BL6J 小鼠\\( 出生 48 h 以內\\) ，無菌條件下取中腦及大腦皮質; PBS 洗滌去除血污，仔細剝除殘余腦膜及血管; 然后將其剪碎成小于1 mm × 1 mm × 1 mm的小塊。1． 25 g / L 的胰酶消化 15 min，并用吸管柔和吹打制成單細胞懸液，加入適量胎牛血清終止消化。200 目篩網過濾，收集細胞懸液，1 200 r/min 離心5 min吸棄上層; 然后加入 DMEM 培養基\\( 含 200 mL / L 胎牛血清\\) ，制成單細胞懸液，調整細胞密度為 1． 5 ×106/ mL，種入預先用多聚-D-賴氨酸包被的培養瓶中，置于 37℃ 50 mL/LCO2培養箱中培養，24 h 后去除未貼壁的死亡細胞及殘余組織碎片。每 3 d 換液 1 次，9 d 后細胞鋪滿瓶底，然后置于恒溫搖床，37℃、180 r/min 離心 18 h，去除小膠質細胞及少突膠質細胞。2． 5 g/L 的胰酶消化后，進行常規傳代培養，用于后續實驗。
1． 2． 2 星形膠質細胞的鑒定 采用免疫熒光法檢測星形膠質細胞純度。將傳至第 2 代的星形膠質細胞接種于蓋玻片上，2 ～3 d 后，將鋪滿細胞的蓋玻片取出，40 g/L 的多聚甲醛固定 30 min，PBS 漂洗 5 min ×3 次，10 g/L 的 BSA 室溫封閉 1 h，加入兔抗小鼠膠質細胞纖維酸性蛋白\\( glial fibrillaryacidic protein，GFAP\\) 抗體\\( 1∶800\\) ，4℃ 孵育過夜。次日，PBS漂洗5 min ×3 次，加入 FITC 標記的抗兔 IgG \\( 1∶1 000\\) ，室溫孵育1 h，PBS 漂洗5 min ×3 次，500 mL/L 甘油封片，熒光顯微鏡下隨機觀察 10 ～12 個視野，采用圖像分析軟件Image-ProPlus 分析并計算熒光陽性細胞的百分比。
1． 2． 3 實驗分組及給藥方法 大腦皮質星形膠質細胞純化后，接種于6 孔細胞培養板中，調整細胞密度為1．5 ×106/ mL，培養 24 h后換基本培養液 \\( 含 200 mL/L 胎 牛 血 清 的DMEM\\) ，分 3 組: 對照組，加 PBS; LPS 刺激組，加入 1 μg /mL LPS; LA 干預組，加 1 μg / mL LPS 后，加 100 μg / mL LA;共同作用 24 h 后收集培養上清。
1． 2． 4 Griess 法測定星形膠質細胞培養上清液中 NO 含量以 NO 的穩定性代謝產物-亞硝酸鹽作為檢測 NO 的指標，采用 Griess 法測定培養液中 NO 的含量。簡述如下: 收集各組細胞培養上清液，分別取 100 μL 上清液至 96 孔酶標板，然后分別加入 50 μL Griess 試劑Ⅰ和50 μL Griess 試劑Ⅱ，充分混勻后室溫靜置 10 min，于 540 nm 處檢測各組吸光度值，以不同濃度亞硝酸鈉\\( NaNO2\\) 建立標準曲線確定 NO 濃度，結果用 μmol/L 表示。
1． 2． 5 星形膠質細胞培養上清液 TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10的檢測 星形膠質細胞進行傳代、分組，藥物處理 24 h后，收集培養上清液，按 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-10 ELISA檢測試劑盒說明書進行操作，測定樣品在 450 nm 的吸光度\\( A\\) 值，根據不同濃度標準品的結果，繪制出標準曲線，得出直線回歸方程。將所測各組樣本的 A 值，代入相應的直線回歸方程中，計算出的 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-10 含量，以pg / mL 表示。
1． 2． 6 反轉錄 PCＲ 法檢測 CCL20、MIP-1α 和 MCP-1 mＲNA表達 各組細胞藥物處理 24 h 后，用 PBS 洗滌細胞，按照TＲIzol 試劑盒說明書提取細 胞 總 ＲNA; ＲT-PCＲ 法 擴 增CCL20、MIP-1α 和 MCP-1 mＲNA: 按逆轉錄酶 MMLV 試劑盒說明書方法進行逆轉錄，取逆轉錄產物進行 PCＲ。GADPH 上游引物序列為 5'-CAGTGGCAAAGTGGAGATTGTTG-3'，下游引物序列為 5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'; MCP-1 上游引物序列為 5'-CTTCTGGGCCTGCTGTTCA-3'，下游引物序列5'-CCAGCCTACTCATTGGGATCA-3'; MIP-1α 上游引物序列為 5'-TGCCCTTGCTGTTCTTCTCT-3'， 下 游 引 物 序 列 為5'-CAGGCATTCAGTTCCAGGTC-3'; CCL20 上游引物序列為:5'-GACTGTTGCCTCTCGT-3'，下游引物序列為: 5'-TGACTCT-TAGGCTGAGGA-3'; PCＲ 反應條件: 95℃ 10 min，94℃ 45 s，60℃ 1 min，72℃ 1 min，共 30 個循環，72℃ 5 min。
1． 2． 7 統計學分析 實驗結果均以 x ± s 表示，采用 SPSS15． 0統計學軟件，組間比較用單因素方差\\( analysis of variance，ANOVA\\) 進行統計學分析，P ＜ 0． 05 為差異有統計學意義。

2 結果

2． 1 大腦皮層星形膠質細胞培養及純度鑒定結果將傳至第 2 代的星形膠質細胞按照 1 ×106/ 孔的密度接種至多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，37℃、50 mL/LCO2培養箱中培養 2 ～ 3 d 后，取出蓋玻片，經過GFAP 免疫組化染色鑒定，蓋玻片上的星形膠質細胞純度達 95%以上\\( 圖 1\\) 。2． 2 LA 對 LPS 刺激細胞釋放 NO 的作用 經 LA預處理、加入 LPS 刺激細胞 24 h 以后，用 Griess 法檢測 NO 水平。結果顯示，與 PBS 組比較，LPS 引起星形膠質細胞分泌 NO 明顯增加\\( 圖 2，P ＜0． 01\\) 。與 LPS 組相比，LA 組 NO 分泌明顯降低\\( P ＜0． 01\\) 。LA 可顯著抑制 LPS 誘導的原代培養小鼠星形膠質細胞釋放 NO。2． 3 LA 對 LPS 激活的星形膠質細胞分泌 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-10 的影響 應用 ELISA 檢測細胞培養上清液中 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-10 的含量，結果表明，LPS 誘導后星形膠質細胞分泌 TNF-α、IL-1β、IL-6 明顯增加\\( P ＜ 0． 01\\) ，IL-10 分泌減少 \\( 圖3，P ＜ 0． 05\\) ，與 PBS 組相比，差異有統計學意義;與 LPS 組相比，LA 干預組 TNF-α、IL-1β、IL-6 的分泌顯著下降，IL-10 分泌增加\\( P ＜ 0． 01\\) ，差異有統計學意義。2． 4 LA 對 LPS 誘導星形膠質細胞 CCL20、MIP-1α 和 MCP-1 mＲNA 的影響 采用反轉錄 PCＲ 法觀察 LA 對 LPS 刺激的星形膠質細胞 CCL20、MIP-1α和 MCP-1 mＲNA 分泌水平的影響，實驗結果表明，LPS\\( 1 μg / mL \\) 刺激 24 h 后，星形膠質細胞的CCL20、MIP-1α 和 MCP-1 的 mＲNA 分泌水平升高，與 PBS 組相比，差異有統計學意義\\( P ＜0． 01，圖4\\) 。LA \\( 100 μg / mL\\) 可抑制 LPS 誘導的 CCL20 mＲNA、MIP-1α mＲNA \\( P ＜ 0． 01 \\) 和 MCP-1 mＲNA 的分泌\\( P ＜0． 05\\) ，與 LPS 組相比，差異有統計學意義。
3 討論

近年來的研究發現，星形膠質細胞不僅作為神經元的支持細胞，同時在中樞神經系統退行性疾病、炎性疾病和缺血性疾病如 AD、PD、MS 和腦梗死中發揮神經毒性和神經保護雙重作用。本研究發現在 LPS 刺激下，星形膠質細胞釋放NO、TNF-α、IL-1β 和 IL-6 明顯增加。過量的 NO 可導致神經元去極化及谷氨酸鹽釋放增加，繼而產生神經興奮毒性。本研究結果顯示，LA 可顯著抑制LPS 刺激星形膠質細胞引起的 NO 產生，繼而發揮神經保護作用。TNF-α、IL-1β 除直接或間接地引起神經元損傷或死亡外，還是觸發免疫和炎癥反應的重要介質，TNF-α 可進一步刺激星形膠質細胞產生更多的細胞因子和化學因子，加快并擴大炎癥反應的發生，從而導致神經細胞的損傷。IL-1β 可以激活炎癥信號通路 NF-κB，我們前期的研究發現，在 EAE小鼠脊髓組織中星形膠質細胞存在較高的NF-κB的表達，而且隨著炎癥信號的抑制，由此啟動的炎性細胞因子如 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 明顯下降。本研究結果也顯示，LA 可明顯下調炎性刺激下星形膠質細胞所產生的 TNF-α、IL-1β 和 IL-6，減少細胞因子及化學因子的進一步釋放，終止惡性循環。與上述致炎性細胞因子相反，IL-10 為經典的免疫調節和抗炎性細胞因子，能有效地抑制 LPS 誘導的膠質細胞分泌致炎性細胞因子。Gresa-Arribas 等的研究結果也證明，IL-10 能抑制 LPS/IFN-γ 誘導的膠質細胞 IL-6 和 TNF-α 的釋放。本研究發現，在 LPS 刺激下，星形膠質細胞 IL-10 分泌減少。而 LA 可增加抗炎性因子 IL-10 的分泌，這可能是 LA 發揮抗炎作用及星形膠質細胞具有神經保護的機制之一。
病理條件下的星形膠質細胞除了釋放細胞因子外，還釋放 MCP-1\\( CCL2\\) 、MIP-1α\\( CCL3\\) 、CCL20等趨化因子。這些趨化因子一方面可吸引和活化單核細胞、中性粒細胞及其他免疫細胞穿過 BBB，進一步加重炎性反應; 另一方面可直接激活神經元表面的趨化因子受體，或間接激活小膠質細胞殺傷機制誘導神經元的死亡。本實驗結果顯示，在 LPS 刺激下，星形膠質細胞 CCL20 mＲNA、MIP-1α mＲNA和 MCP-1 mＲNA 顯著升高。IL-1β 可刺激 CD4+T 細胞產生 IL-9，而 IL-9 誘導的星形膠質細胞 CCL20 二次高表達使更多的 Th17 細胞遷移進入 EAE 炎性病灶。CCL2、CCL3 可促使不同的 CD4+T 細胞亞群與 BBB 內皮細胞結合，并穿過 BBB，并在 MS 炎性浸潤的不同階段發揮重要作用。此外，AD 患者腦脊液中 MCP-1 顯著升高，而且 MCP-1 的顯著升高能加速 AD 患者認知能力的下降?？梢娳吇蜃釉诙喾N神經系統退行性疾病的發病機制中具有重要作用。本實驗結果顯示，LA 可明顯抑制 LPS 誘導的趨化因子 CCL20、MIP-1α、MCP-1 mＲNA 的表達，這可能是 LA 在神經系統退行性疾病中發揮抗炎及神經保護作用的另外一個機制。值得注意的是，除 LPS直接誘導趨化因子的釋放外，TNF-α、IL-1β 和 IL-6也能間接誘導星形膠質細胞 MCP-1\\( CCL2\\) 、MIP-1α\\( CCL3\\)和 CCL20 mＲNA的表達，從而形成細胞因子與趨化因子間復雜的級聯網絡，使炎癥反應不斷放大，加重神經元的損傷。
綜合以上實驗結果，LA 能顯著抑制 LPS 誘導的星形膠質細胞 NO、致炎性細胞因子及趨化因子的釋放，證明 LA 通過抗炎抗氧化在神經系統退行性疾病中發揮一定的保護作用，但其具體的分子機制還需要進一步探討。

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