小腸缺血再灌注損傷\\( small intestinal ischemia-reperfusion injury，IIＲI\\) 是一種臨床常見的病理現象，常危 及 生 命。腸 系 膜 上 動 脈 \\( superior mesentericartery，SMA\\) 阻塞或失血性休克等許多損傷因素都能導致小腸缺血再灌注損傷的發生。小腸缺血再灌注可導致嚴重的局部創傷并引起多器官功能障礙，?？衫奂暗椒谓M織，而且有研究顯示繼發的急性肺損傷\\( acute lung injury，ALI\\) 或/和急性呼吸窘迫綜合征\\( acute respiratory distress syndrome，AＲDS\\) 是造成小腸缺血再灌注損傷病人死亡的主要原因。因此，為找到新的防治措施，降低小腸缺血再灌注損傷患者的死亡率，進行小腸缺血再灌注肺損傷分子機制的研究是非常關鍵和必要的。
具有 CCCH 鋅指結構域的蛋白 12D\\( zinc fingerCCCH type containing 12d，Zc3h12d\\) ，也稱為 TFL 或P34，是近期發現的包含單個鋅指結構域蛋白家族中的一員，擁有相對分子質量 \\( Mr\\) 58 000 和36 000 兩 種 剪 接 體， 在 炎 癥 因 子 或 脂 多 糖\\( lipopolysaccharide，LPS\\) 刺激單核細胞時其表達量會發生變化，從而對細胞的生理和病理過程產生影響。然而 Zc3h12d 在動物肺損傷中的表達尚未見報道。本實驗通過建立大鼠 IIＲ 肺損傷模型，初步觀察 Zc3h12d 在急性肺損傷大鼠肺中的表達情況并探討其可能的作用及意義，為進一步了解 IIＲ 肺損傷發生、發展的分子機制奠定基礎。
1 材料和方法
1． 1 材料 純化 LPS、兔抗大鼠 β-actin 抗體、辣根過氧化酶標記的兔抗山羊 IgG、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG 購自 Sigma 公司; 山羊抗大鼠 Zc3h12d 抗體購自 Santa Cruz 公司; 大鼠 TNF-α、IL-1β ELISA 試劑盒購自北京鼎國生物技術公司; 兩步法免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司; TＲIzol 試劑盒、逆轉錄試劑盒及實時定量 PCＲ\\( realtime quantitative PCＲ，qＲT-PCＲ\\) 試劑盒購自大連 TaKaＲa 公司; SDS 細胞裂解液、ECL 顯色液購自西安晶彩生物技術公司; BCA 蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。電熱恒溫干燥箱為北京科偉永興儀器有限公司產品，熒光顯微鏡為徠卡公司產品，紫外分光光度計為 Beckman 公司產品，實時定量 PCＲ 儀、Western blot 蛋白電泳儀為 Bio-Ｒad公司產品。
1． 2 方法
1． 2． 1 實驗動物分組與模型制備 健康雄性 SPF 級 SD 大鼠40 只，體質量 200 ～ 230 g，由第四軍醫大學動物實驗中心提供。大鼠隨機分為對照組\\( contro1\\) 、缺血再灌注 30 min 組\\( IＲ30 min\\) 、缺血再灌注 60 min 組\\( IＲ60 min\\) 和缺血再灌注120 min 組\\( IＲ120 min\\) ，每組 10 只，均適應性飼養 7 d 后用于實驗。實驗前禁食 12 h，自由飲水。10 g/L 戊巴比妥納40 mg / kg腹腔注射麻醉，經大鼠口氣管插管并連接呼吸機。
麻醉后常規備皮消毒，行正中開腹手術，切口 3 ～4 cm 入腹，探查大鼠腹腔內情況; 探查后將全部消化道及網膜向右掀起，找到腹主動脈分支腸系膜上動脈\\( superior mesenteric artery，SMA\\) 并鈍性分離; 對照組大鼠縫合切口，3 個缺血再灌注組以無創傷動脈夾夾閉 SMA 起始部，缺血 60 min 后恢復再灌注，分別再灌注 30 min、60 min 和 120 min; 過量戊巴比妥納腹腔注射，麻醉處死。
1． 2． 2 肺組織濕質量 / 干質量\\( W / D\\) 比值測定 取大鼠右肺上葉稱取質量為濕重，而后放入70℃恒溫干燥箱中烘烤12 h 稱質量為干質量，以濕質量/干質量得出肺濕干質量\\( W/D\\) 比值。
1． 2． 3 ELISA 檢測血清及肺組織上清液中 IL-1β 及 TNF-α 水平 心臟取血制備血清，取左肺葉一部分制備組織勻漿液，采用 ELISA 檢測血清及肺組織上清 IL-1β 及 TNF-α 的水平。
心臟取血約3 mL，37℃水浴加熱 30 min 后，4℃ 2 000 g 離心20 min，收集上清即血清，取肺組織約 300 mg，用 0． 01 mmol / LPBS\\( pH7． 4\\) 1． 5 mL 充分勻漿后，4℃ 12 000 g 離心 20 min，收集上清，兩者均采用雙抗體夾心 ELISA 進行檢測。
1． 2． 4 肺組織病理學檢查 取右肺中下葉置于 100 mL / L 的中性甲醛中固定 24 h、梯度酒精脫水、石蠟包埋，保存于4℃ 。使用時切片\\( 厚度 3 μm\\) 、HE 染色、中性樹膠封片，光鏡下觀察肺組織病理形態學改變。
1． 2． 5 肺組織 Zc3h12d 蛋白免疫組化染色 肺組織石蠟切片常規脫蠟至水后，尿素消化; 檸檬酸緩沖液中微波加熱修復抗原，50 g/L 過氧化氫封閉內源性過氧化物酶。按兩步法免疫組化染色: 滴加 BSA 封閉 30 min，封閉后甩去 BSA，加山羊抗大鼠 Zc3h12d 抗體，4℃冰箱孵育過夜; 37℃水浴復溫45 min，滴加辣根過氧化物酶標記的兔抗山羊二抗室溫孵育45 min; DAB 顯色、適時終止; 蘇木素復染胞核，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察拍照。陰性對照以 PBS 代替一抗。
1． 2． 6 qＲT-PCＲ 檢測 使用 TＲIzol 試劑盒提取肺組織總ＲNA，紫外分光光度計測定 ＲNA 含量、純度。根據含量將提取的 ＲNA 調制成相同濃度，進行逆轉錄，Zc3h12d 上游引物為 5'-GGTCAGCACAATCCACCATCA-3'，下游引物為 5'-TG-TATCCCACCTACCCAAGCA-3'; 內參照為 β-actin，上游引物為5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游引物為 5'-GACT-CATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'。 反 應 條 件 為 37℃ 孵 育40 min，70℃ 10 min。使用 SYBＲ\ue4d1GreenⅠＲeal Time PCＲ 法擴增 cDNA，擴增條件: 95℃ 10 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，重復 30 個循環。以 β-actin 為內參照，使用 2－ △△Ct相對定量計算公式計算 Zc3h12d 的 mＲNA 相對表達量。
1． 2． 7 Western blot 檢測肺組織 Zc3h12d 蛋白的表達 取肺組織100 ～200 mg，加入適量 SDS 細胞裂解液、PMSF，于冰上充分勻漿; 4℃、12 000 r/min 離心20 min，取上清，BCA 法蛋白定量; 加上樣緩沖液煮沸 5 min，保存于 －70℃。每孔上樣蛋白濃度為 40 μg 進行 SDS-PAGE，電泳后轉移到 NC 膜上。
滴加 50 g/L 脫脂牛奶 50 mL 封閉 1 h，使用山羊抗大鼠Zc3h12d 抗體及辣根過氧化物酶標記的兔抗山羊 IgG 孵育目的蛋白，以觀察 Zc3h12d 蛋白兩種剪接體的表達情況，用兔抗大鼠 β-actin 抗體及山羊抗兔 IgG 孵育內參照 β-actin 蛋白。ECL 顯色，凝膠成像系統觀察并照相。
1． 2． 8 統計學分析 實驗數據錄入 SPSS16． 0 統計軟件進行統計分析。各組數據以 x ± s 表示，組間比較采用單因素方差分析\\( One-way ANOVA\\) 。檢驗水準 α = 0． 05，P ＜ 0． 05 表示差異有統計學意義。
2 結果
2． 1 肺組織濕 /干質量比值 小腸上動脈缺血再灌注肺損傷\\( IIＲI\\) 模型組與對照組相比，IＲ30 min 組比值開始增大\\( F =6． 56，P ＜0． 05\\) ，表明肺微血管通透性開始增加，肺水腫形成，IＲ60 min 組比值大于對照組\\( F =3． 19，P ＜0． 05\\) ，IＲ120 min 組比值增幅較IＲ60 min 減小但仍大于對照組\\( F = 1． 66，P ＜ 0． 05\\) ，表明在IＲ60 min 組和IＲ120 min 組大鼠仍有肺水腫\\( 圖1\\) 。2． 2 血清和肺組織勻漿中 TNF-α 和 IL-1β 的變化ELISA 檢測結果顯示 IＲ 致傷后，IＲ30 min 組大鼠血清和肺勻漿中 TNF-α 濃度較對照組升高\\( F =43． 91，P ＜ 0． 05; F = 41． 44，P ＜ 0． 05\\) ，同時肺勻漿中 IL-1β濃度也較對照組升高\\( F = 9． 80，P ＜ 0． 05\\) 。IＲ60min 組較 IＲ30 min 組血清和肺勻漿中 TNFα 濃度升高\\( F =28． 81，P ＜0． 05; F =20． 30，P ＜0． 05\\) ，血清中 IL-1β 濃度也升高\\( F = 8． 89，P ＜ 0． 05\\) 。IＲ120min 組較 IＲ60 min 組血清和肺勻漿中 TNF-α 濃度升高\\( F =28．95，P ＜0．05; F =10．23，P ＜0．05\\) ，同時血清中 IL-β 濃度也升高\\( F =4．60，P ＜0．05，圖2\\) 。2． 3 肺組織病理學變化 對照組肺小葉結構完整，肺泡間隔無增厚，無滲出，血管周圍未見炎癥細胞浸潤。IＲ 致 ALI 模型組可見肺泡毛細血管破壞，肺泡壁明顯增厚，肺泡腔內可見大量粉紅色滲出液和紅細胞，間質大量炎癥細胞浸潤，有明顯的炎癥改變\\( 圖3\\) 。2． 4 肺組織 Zc3h12d 的表達 肺組織 Zc3h12d 主要在肺泡細胞和肺間質細胞中表達，分布于細胞質中，呈棕黃色，而細胞核中未見明顯表達，IＲ30 min 和IＲ60 min 組 與 對 照 組 相 比 染 色 無 明 顯 變 化，IＲ120 min組染色與對照組相比明顯變淺，呈淡黃色，為弱陽性\\( 圖 4\\) 。2． 5 qＲT-PCＲ 檢測樣本肺組織 Zc3h12d mＲNA 的表達 紫外分光光度計檢測大鼠肺組織 A260 / A280比值，均在 1． 8 ～2． 0 之間，顯示總 ＲNA 完整性好，純度較高。肺組織中的 Zc3h12d mＲNA 熒光定量擴增曲線呈 S 型，溶解曲線為單峰，無非特異性擴增及引物二聚體形成，結果可靠，故使用 qＲT-PCＲ 測定Zc3h12d 的 mＲNA 相對含量，發現 IＲ30 min 肺損傷模 型 組 中 mＲNA 表 達 較 對 照 組 無 明 顯 變 化\\( F =0． 22，P ＞ 0． 05\\) ; IＲ60 min 組、IＲ120 min 組mＲNA 與對照組相比表達明顯減少 \\( F = 5． 65，P ＜ 0． 05; F = 15． 75，P ＜ 0． 05 \\) ，但 IＲ30 min 組 與IＲ60 min 組、IＲ60 min 組與 IＲ120 min 組 mＲNA 表達比較無明顯差異\\( F = 3． 14，P ＞ 0． 05，P = 0． 0931;F = 4． 40，P ＞ 0． 05，P = 0． 0504; 圖 5\\) 。2． 6 Western blot 法檢測肺組織 Zc3h12d 蛋白的表達 Western blot 法檢測以 Zc3h12d/β-actin 吸光度值為結果，計算 Zc3h12d 蛋白的相對表達量，檢測結果顯示各組肺組織都有 Zc3h12d 蛋白的表達，但僅有相對分子質量\\( Mr\\) 58 000 剪接體而無 Mr36 000 剪接體表達; IＲ30 min 組、IＲ60 min 組和對照組相比無明顯減少\\( F =0． 22，P ＞0． 05，P ＞ 0． 05; F = 5． 65，P ＞ 0． 05，P ＞ 0． 05\\) ; IＲ120min 組與對照組相比表達明顯減少\\( F =9． 11，P ＜0． 05\\) ; IＲ60 min 組與 IＲ30min 組比較無明顯變化\\( F = 0． 35，P ＞ 0． 05\\) 而 IＲ120min 組比 IＲ60 min 組表達量明顯減少\\( F = 4． 85，P ＜0． 05，圖 6\\) 。3 討論
臨床上小腸缺血再灌注損傷\\( IIＲI\\) 可由敗血癥、缺血、小腸移植、嚴重燒傷等多種病理生理改變引起，并導致一系列嚴重的組織器官損傷，其中主要包括 ALI 或/和 AＲDS。目前 IIＲI 的機制和治療受到了廣泛的研究，雖然其確切的機制還沒有得到闡明，但是活性氧和炎癥信號通路被認為在其中扮演了重要的角色。研究顯示 NF-κB 通路在炎癥反應和固有免疫中處于中心地位，并受到多種轉錄后調節，包括磷酸化和泛素化，而去泛素化酶\\( deubiquitinating enzymes，DUB\\) 被確定可以下調 NF-κB 的信號轉導，從而達到抑制炎癥反應的作用。Zc3h12d 是一種新發現鋅指蛋白，因蛋白結構中有一個鋅指結構域而得名。這一蛋白家族共有Zc3h12a、Zc3h12b、Zc3h12c、Zc3h12d 四種蛋白，其氨基酸序列同源性很高，但組織分布差異性很大。
Zc3h12d 主要分布于淋巴細胞、淋巴結、脾臟和肺組織中，且其 Mr58 000 及 36 000 剪接體的組合分布不同。這個蛋白家族研究較多的是 Zc3h12a，據文獻報導 Zc3h12a 是一種 DUB，具有轉錄因子作用，炎癥抑制作用和 miＲNA 及 mＲNA 的降解作用，其炎癥抑制作用主要是通過去泛素化 NF-κB 等炎癥通路來實現的，研究發現和 Zc3h12a 分子結構很相似的 Zc3h12d 不僅有調節細胞周期的作用，而且也和抑制肺癌有關，據猜測 Zc3h12d 是通過抑制 NF-κB信號通路起到抑制肺癌的作用，進一步的細胞實驗證實 Zc3h12d 具有去泛素化作用，當巨噬細胞受到 LPS、鞭毛蛋白等多種外來抗原的刺激時，激活核轉錄因子 NF-κB，NF-κB 的激活會誘導 Zc3h12d 基因表達上調，而后產生大量的 Zc3h12d 蛋白再抑制NF-κB 信號通路，形成一個負反饋通路。這些研究表明 Zc3h12 蛋白可以通過調節 NF-κB 信號通路來抑制炎癥反應，但是其具體的作用靶點及自身的調節機制仍然不清，動物實驗也尚未見報道。
本實驗通過夾閉 SD 大鼠腸系膜上動脈并進行再灌注，模擬臨床小腸缺血再灌注肺損傷建立大鼠急性肺損傷模型。通過檢測肺濕/干質量比\\( W/D\\)發現小腸缺血再灌注\\( IIＲ\\) 后大鼠形成持續性的肺水腫，ELISA 檢測發現血清及肺組織中的炎癥因子TNF-α、IL-1β 在缺血再灌后呈現不斷升高的趨勢，表明肺內炎癥反應激活，炎癥介質過度表達，引起了不可控的炎癥反應，結合大鼠肺組織典型的肺損傷病理改變，表明大鼠小腸缺血再灌注肺損傷模型建立成功。通過免疫組織化學檢查發現 Zc3h12d 蛋白存在于正常大鼠肺組織中，并分布于細胞質中，在再灌注損傷后，Zc3h12d 蛋白的表達呈下降的趨勢但未見明顯轉位。qＲT-PCＲ 及 Western blot 檢查顯示，急性肺損傷 120 min 后 Zc3h12d 在 mＲNA 和蛋白水平的表達都明顯降低，表明大鼠小腸缺血再灌注肺損傷后，炎癥反應的激活下調了 Zc3h12d 的表達，這些結果結合先前的研究提示 Zc3h12d 蛋白在肺損傷中扮演保護性的角色，且受到了一定的調節。
目前研究認為 Zc3h12d 蛋白的兩種剪接體無生物功能差異，而本實驗通過 Western blot 檢查發現在大鼠肺組織中僅有 Mr58 000 剪接體的表達，這些結果對研究 Zc3h12d 兩種剪接體的功能提供了新的思路，為進一步研究小腸缺血再灌注肺損傷的分子調節機制奠定了基礎。
參考文獻:
［1］Harward TＲ，Brooks DL，Flynn TC，et al． Multiple organ dysfunctionafter mesenteric artery revascularization［J］． J Vasc Surg，1993，18\\( 3\\) : 459 －467．
［2］Mallick IH，Yang W，Winslet MC，et al． Ischemia-reperfusion injuryof the intestine and protective strategies against injury［J］． Dig DisSci，2004，49\\( 9\\) : 1359 － 1377．
［3］ Brun-buisson C，Minelli C，Bertolini G，et al． Epidemiology andoutcome of acute lung injury in European intensive care units resultsfrom the ALIVE study［J］． Intensive Care Med，2004，30\\( 1\\) : 51－ 61．
［4］ Collard CD，Gelman S． Pathophysiology，clinical manifestations，and prevention of ischemia-reperfusion injury［J］． Anesthesiology，2001，94\\( 6\\) : 1133 － 1138．
［5］ Oldenburg WA，Lau LL，Ｒodenberg TJ，et al． Acute mesentericischemia: a clinical review［J］． Arch Intern Med，2004，164\\( 10\\) :1054 － 1062．
［6］ Huang SP，Qi DF，Liang J，et al． Putative tumor suppressorZc3h12d modulates Toll-like receptor signaling in macrophages［J］．Cell Signal，2012，24\\( 2\\) : 569 － 576．
［7］Minagawa K，Yamamoto K，Nishikawa S，et al． Inhibition of G1 to Sphase progression by a novel zinc finger protein P58 TFL at P-bodies［J］． Mol Cancer Ｒes，2009，7\\( 6\\) : 880 －889．
［8］Liang J，Wang J，Azfer A，et al． A novel CCCH-zinc finger proteinfamily regulates proinflammatory activation of macrophages［J］． JBiol Chem，2008，283\\( 10\\) : 6337 － 6346．
［9］楊 波，張志培，姜 鵬，等． N-myc 下游調節基因-2 在大鼠腸缺血再灌注肺損傷中的表達及其與 NF-κB p65 的相關研究［J］．創傷外科雜志，2012，14\\( 6\\) : 543 －546．
［10］ K\ue56ehler HF，DeLucca IM，Sbragia Neto L． Enteral antioxidants inischemia / reperfusion injuries in rats［J］． Ｒev Col Bras Cir，2011，38\\( 6\\) : 422 － 428．
［11］Berlanga J，Prats P，Ｒemirez D，et al． Prophylactic use of epidermalgrowth factor reduces ischemia / reperfusion intestinal damage［J］．Am J Pathol，2002，161\\( 2\\) : 373 － 379．
［12］Chen ZJ． Ubiquitination in signaling to and activation of IKK［J］．Immunol Ｒev，2012，246\\( 1\\) : 95 － 106．
［13］Tokunaga F，Iwai K． Linear ubiquitination: A novel NF-κB regulatorymechanism for inflammatory and immune responses by the LUBACubiquitin ligase complex［J］． Endocr J，2012，59 \\( 8\\) : 641 － 652．
［14］Harhaj EW，Dixit VM． Deubiquitinases in the regulation of NF-κBsignaling［J］． Cell Ｒes，2011，21\\( 1\\) : 22 － 39．
［15］Liang J，Song W，Tromp G，et al． Genome-wide survey and expressionprofiling of CCCH-zinc finger family reveals a functional module inmacrophage activation［J］． PLoS One，2008，3\\( 8\\) : e2880．
［16］Jura J，Skalniak L，Koj A，et al． Monocyte chemotactic protein-1-induced protein-1 \\( MCPIP1\\) is a novel multifunctional modulator ofinflammatory reactions［J］． Biochim Biophys Acta，2012，1823\\( 10\\) : 1905 －1913．
［17］Xu J，Peng W，Sun Y，et al． Structural study of MCPIP1 N-terminalconserved domain reveals a PIN-like ＲNase nucleic acids research［J］． Nucleic Acids Ｒes，2012，40\\( 14\\) : 6957 －6965．
［18］Wang M，Vikis HG，Wang Y，et al． Identification of a novel tumorsuppressor gene p34 on human chromosome 6q25． 1［J］． CancerＲes，2007，67\\( 1\\) : 93 － 99．
［19］ Minagawa K，Yamamoto K，Nishikawa S，et al． Deregulation of apossible tumour suppressor gene，ZC3H12D，by translocation of IGK@ in transformed follicular lymphoma with t\\( 2; 6\\) \\( p12; q25\\) ［J］．Br J Haematol，2007，139\\( 1\\) :161 － 163．
