肺血管急性缺氧性收縮反應和慢性缺氧性肺血管結構重建是缺氧性肺動脈高壓發生的主要機制，肺血管重構最重要的病理變化是肺動脈平滑肌細胞\\(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs\\)從中膜大量遷移至內膜合并凋亡和增生的失衡。研究表明，缺氧性肺動脈高壓血管結構重建在遠端肺動脈表現的比近端肺動脈更加顯著，而且在低氧條件下離體肺血管收縮實驗中，小動脈的收縮及敏感性遠遠高于大動脈?？梢娦用}的病理變化在疾病過程中起到了至關重要的作用。但是在同樣的病理刺激下，小動脈更容易發生重構的機制尚不明確。因此，探索并且驗證肺小動脈與大動脈功能的差異，初步分析小動脈更易發生重構可能的病理、生理機制，對于預防早期肺血管的重構以及延緩肺動脈高壓的發生、發展至關重要。本研究利用原代培養的大鼠不同級別 PASMCs，探討了低氧對不同級別 PASMCs 增生及遷移的影響。

1 材料與方法

1． 1 主要試劑及儀器平滑肌細胞基礎培養基 \\(dulbecco’s modifiedeagle’s medium，DMEM\\)購于美國 Sciencell 公司;胎牛血清\\(fetal calf serum，FBS\\)購于美國 Gibcobrl 公司;青霉素、鏈霉素均購于美國 Invitrogen 公司;胰蛋白酶、二甲基亞砜\\(dimethyl sulfoxide，DMSO\\)等試劑購于美國Sigma 公司; EDTA、四甲基偶氮唑鹽 \\( methyl thiazolyltetrazolium，MTT\\)購于美國 Amresco 公司;PCNA 購于美國 Santa Cruz Biotecnology;平滑肌肌動蛋白\\(α-smoothmuscle actin，α-SMA\\)購于英國 Abcam 公司;β-actin 購于美國 Sigma 公司。其余試劑均為國產分析純。

1． 2 實驗方法

1\\) 大鼠 PASMCs 的原代培養:取體質量約為250 ～ 300 g 健康雄性 SD 大鼠 4 只，由首都醫科大學動物實驗中心提供，實驗動物許可證號:SYXK\\(京\\)2010-0020。腹腔注射 2% 戊巴比妥鈉\\(50 mg / kg\\) 麻醉后，無菌操作下迅速分離出心肺組織，置于盛有含有 1%青鏈霉素的 PBS 培養皿中，體式顯微鏡下分離各肺葉的肺動脈。按照肺動脈的分級將肺血管分為 3組:大動脈組\\(n =4\\)，包括肺動脈干及肺內一級主干;中動脈組\\(n =4\\)，包括肺內主干的二級及三級分支;小動脈組\\(n =4\\)，包括肺內動脈四級以上分支。用眼科鑷小心剝除外膜，縱向剪開肺動脈，用刮匙來回輕刮 2 ～ 3 遍，去除內膜，僅留中膜平滑肌組織層，用眼科剪反復剪成 1 mm ×1 mm 的小組織塊，隨后放入預先盛有3 mL Ⅱ型膠原酶消化液\\(1 800 U/mL\\)的離心管中 37 ℃水浴靜置 20 min，待組織邊緣呈現絮狀后，1 000 r / min 離心 5 min，棄上清液，向組織沉淀中加入含 10%胎牛血清的 DMEM 培養基，輕輕吹打，制成細胞懸液接種于 35 mm 培養皿中，于 5% CO2培養箱 37℃ 培養。
2\\) 實驗分組:每次實驗前取狀態良好的 4 ～ 7 代對數生長期細胞，當細胞貼壁生長至 80% ～90% 融合時進行細胞計數后分組接種。待細胞貼壁后換為無血清 DMEM 培養基培養24h 使細胞同步化，再采用數字表法隨機分為:常氧對照組\\(DMEM + 2% FBS、5%CO2、21%O2、37 ℃培養 48 h\\);低氧處理組\\(DMEM +2% FBS、5% CO2、3%O2、37 ℃培養 48 h\\)。
3\\) 大 鼠 PASMCs 的 免 疫 熒 光 鑒 定: 將 大 鼠PASMCs 接種于 24 孔板內的蓋玻片上，單層鋪滿后，搜集細胞爬片，4%的多聚甲醛室溫固定 30 min，加入10% 羊血清封閉 30 min。0． 2% Triton X-100 溶液室溫孵育 30 min。加入一抗\\(anti-α-SMA，1∶ 100\\)4 ℃孵育過夜，Alexa Fluor 488 標記的二抗 IgG \\(1∶ 100\\)室溫避光孵育 1 h。用含 DAPI 的封片劑封片后激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察結果。
4\\)MTT 法檢測:以每孔 5 × 103個細胞接種于 96孔板，每組設 6 個復孔，設不加細胞只加培養液的孔為空白孔。待細胞貼壁后加入無血清 DMEM 培養基培養 24 h 使細胞同步化，分 2 組，分別在常氧和低氧條件下培養 48 h。干預結束后，每孔加入 200μL 新配制的 MTT\\(0． 5 g/L\\)，置于 37 ℃、5% CO2培養箱內繼續孵育 4 h。棄去上清液后每孔加入 150 μL 二甲亞砜\\(DMSO\\)，將 96 孔板置于全波長酶標儀中低速振蕩 10 min，選擇 490 nm 波長，在酶標儀上測定各孔的吸光度值。實驗重復 3 次。
5\\)Western blotting 檢測: 取分組處理后的大鼠PASMCs，棄培養基，PBS 清洗 2 遍，加入預冷的 ＲIPA蛋白裂解液\\(含1%蛋白酶抑制劑\\)30 μL 裂解細胞，15min 后收集至 1． 5 mL EP 管中，超聲作用 3 次，冰上靜置 30 min 后 4 ℃、12 000 r/min 離心 5 min，吸取上清BCA 法測蛋白濃度。蛋白樣品，進行 12% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳\\(sodium dodecyl sulfate-poly-acrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE\\) 電泳，NC 轉膜，脫脂奶粉非特異性封閉后，加入 PCNA\\(1∶ 200\\)和β-actin\\(1∶ 2 000\\)，4 ℃過夜，IＲDye 800CW 連接的二抗\\(1∶ 10 000\\)避光孵育 1 h，用 Odyssey 紅外熒光成像系統檢測蛋白相對含量。以 Image J 軟件對蛋白表達條帶進行灰度掃描及定量分析。
6\\) 傷口愈合實驗:將大鼠 PASMCs 接種于 6 孔板中，生長至 100% 匯合后用 1 mL 槍頭在孔板底部作2 ～ 3 條平行的劃痕，分 2 組處理 48 h 后，低倍鏡下觀察細胞傷口愈合情況。

1． 3 統計學方法

應用 Graph Pad Prism 5． 0 分析作圖軟件和 SPSS13． 0 統計學軟件進行數據處理，數據采用平均值 ± 標準誤\\(x珋 ± SE\\)表示，多樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 LSD 統計學方法。以 P ＜0． 05為差異有統計學意義。

2 結果

2． 1 細胞形態學鑒定與免疫熒光鑒定

經倒置相差顯微鏡觀察，3 組肺動脈組織經原代培養 2 ～3 d 后，逐漸有細胞從組織塊中爬出，細胞貼壁生長，呈長梭形放射狀，7 ～ 10 d 后細胞逐漸融合，呈現出典型的平滑肌細胞“峰 － 谷”狀生長特點\\(圖1\\) ，且 3 組細胞在形態上未表現出明顯差異。α-SMA的細胞免疫熒光顯示，3 組細胞的細胞質中均有較多與細胞縱軸相平行的絲狀綠色熒光，即為平滑肌細胞特有的肌動蛋白，表明本實驗條件下培養的細胞主要為 PASMCs\\(圖 2\\)。
PCNA 是增生細胞核抗原，與細胞 DNA 合成關系密切，在細胞增生的啟動中起重要作用，其表達含量代表細胞的增生能力。Western blotting 的結果也顯示出，在常氧條件下，3 組 PASMCs 內 PCNA 表達含量灰度值分別為\\(0． 415 ± 0． 052，0． 551 ± 0． 089，0． 381 ±0． 108，n = 4，P ＞ 0． 05\\)，無明顯表達差異。低氧干預后，中小肺動脈組 PASMCs 的 PCNA 表達含量明顯升高，分別為 0． 853 ±0． 023 和 0． 885 ±0． 089，顯著高于大肺動脈組 PASMCs 的 PCNA 表達含量\\(0． 509 ±0． 028\\)，差異均有統計學意義\\(n = 4，P ＜ 0． 01，圖3B\\)，進一步說明中小肺動脈平滑肌細胞增生能力高于大肺動脈平滑肌細胞。
2． 3 低氧對 3 組大鼠 PASMCs 遷移功能的不同影響

選取生長狀態良好的同一代 PASMCs 進行實驗，待細胞貼壁后用無血清 DMEM 培養基饑餓 24 h 使細胞同步化，隨后用槍頭在培養皿底部作 2 ～3 條平行的劃痕，按照分組情況給予常氧和低氧干預 48 h 后，分別對遷移到空白區域的細胞個數進行計數。常氧條件下，3 組 PASMCs 的細胞遷移數量分別為\\(49． 000 ±7． 810，68． 000 ± 7． 767，71． 000 ± 4． 041，n = 3，P ＞ 0． 05\\)，差異均無統計學意義。而在低氧干預后，中小肺動脈組的 PASMCs 遷移到空白區域的細胞個數分別為102． 300 ± 4． 842 和 141． 000 ± 9． 644，均顯著高于大肺動脈組 PASMCs 的細胞遷移數量 62． 670 ±5．044，差異均有統計學意義\\(n =3，P ＜0．01，圖4\\)。
3 討論

肺動脈高壓是由多種發病機制引起的以肺動脈收縮增強、中小肺動脈重構為主要病理、生理變化，最終導致肺血管阻力持續性增加、肺動脈壓力升高的復雜性疾病。肺動脈的重構主要表現為 PASMCs 的增生與肥大，管壁變厚，內徑變窄等。
在臨床肺動脈高壓的患者以及肺動脈高壓的動物模型中，均發現肺血管重構主要發生在末端的小動脈，并且呈逐漸進展性，最終導致末端血管的閉塞，提示肺動脈高壓發生的主要部位在遠端肺動脈，有研究顯示，大鼠肺內一級動脈主干直徑為 600 ～800 μm，二級動脈分支直徑為 400 ～ 600 μm，三級動脈分支直徑為 100 ～ 400μm，而四級動脈分支及以上，動脈直徑只有不到100μm。
在低氧28 d 后，直徑小于200 μm 的微小肺動脈已經閉塞消失，在低氧性肺血管收縮實驗中，小動脈的收縮及敏感性高于大動脈，血管直徑的動脈變化顯示，小于500 μm 的中小肺動脈有一個明顯的減少過程，而其中最顯著的變化則發生在直徑為 200 ～ 300 μm 的肺動脈中。但是對于不同級別肺血管反應性不同的細胞與分子機制目前尚不清楚。
本研究采用膠原酶消化法原代培養正常大鼠 3 組PASMCs，獲得的 PASMCs 呈長梭形，培養2 ～3 d 后呈簇狀或并行排列生長，7 ～10 d 后細胞融合呈“峰-谷”狀生長，表現出典型的血管平滑肌細胞形態學特征。平滑肌α-SMA 蛋白是血管平滑肌表達的特征蛋白。本實驗通過激光共聚焦熒光顯微鏡免疫熒光染色發現，大鼠 3組 PASMCs 免疫熒光染色呈陽性反應，可見典型的、并行排列的綠色纖維，證實 PASMCs 表達平滑肌 α-SMA 蛋白，符合血管平滑肌細胞的免疫學結構特征。
PASMCs 由收縮型向合成型轉換即增生能力增強并從肺動脈中膜遷移至內膜\\(遷移功能增強\\)是低氧導致肺血管重構的關鍵環節。本實驗將原代培養 PASMCs 分別暴露于常氧與低氧環境中，用 MTT 和Western blotting 的方法檢測細胞增生情況，用傷口愈合實驗檢測細胞的遷移能力，發現在低氧條件下中小肺動脈組 PASMCs 的增生與遷移能力均顯著高于大肺動脈組 PASMCs，因此 3 組肺動脈的確在生理條件下已存在某些潛在的差異，使得在低氧時中小肺動脈更加敏感，促使其更易發生血管重構。
以往有研究認為可能與分布在肺的大動脈和小動脈的平滑肌屬性的不同和中層平滑肌細胞在肺近端與遠端動脈的細胞組成上的不同有關。肺小動脈平滑肌細胞的細胞表型，細胞內骨架蛋白的表達和離子通道的開放情況與大動脈相比同樣存在著顯著的差異，這有可能是其具有特殊功能的原因之一。缺氧可以通過抑制 K+通道來促進膜的去極化，從而激活 L-型 Ca2 +通道最終使得小肺動脈發生收縮。在低氧條件下，平滑肌細胞內 K+通道的表達與功能不同，影響蛋白表達的轉錄因子也不同。
本研究尚存在許多不足。首先只是根據血管的分支將肺動脈分成了 3 組，并沒有嚴格的根據血管直徑進行劃分;其次，本研究只是在細胞水平上進行的相關功能的研究，并沒有在組織水平上研究低氧對于3 組血管重構的影響;第三，關于低氧對 3 組 PASMCs其他相關細胞功能，例如對細胞凋亡的功能影響有待進一步深入研究。
綜上所述，本研究在細胞水平上證實了肺大中小肺動脈 PASMCs 確實存在著功能上的差異，在低氧條件下，中小肺動脈組 PASMCs 增生及遷移能力更強。本實驗結果為進一步研究肺小動脈易發生重構的機制提供了一定的理論依據。

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